墨尔本大学综述冷冻凝胶《JMCB》晶体生长大孔凝胶,澳微帮微信公众号文章

水凝胶可模拟细胞外基质（ECM）的凝胶状性质，因而可作为哺乳动物细胞生长和增殖的支持材料。冷冻凝胶（Cryogels）由于固有的相互连接的大孔结构和易于形成的特性，在组织工程和体外细胞培养领域引起了极大的兴趣。它们不仅为细胞的三维（3D）组织和开孔形态提供必要的结构，以允许营养供应和废物代谢产物的去除，最重要的是，相互连通的大孔允许细胞迁移和增殖，有利于血液血管向内生长。澳大利亚墨尔本大学的Andrea J. O'Connor团队综述可用于合成生物相容性和生物学相关冷冻凝胶技术和最新进展，介绍物理化学表征技术，并讨论了冷冻凝胶应用的新兴趋势，特别是作为用于细胞培养和组织工程的三维ECM模拟支架。文章以“Cryogels for biomedical applications”为题发表于期刊《Journal of Materials Chemistry B》

1.低温固化与常规方法生产大孔凝胶

最常见制造大孔水凝胶的方法是依靠水凝胶形成溶液中的物理中断，中断在胶凝后去除（图2a）。物理中断（称为致孔剂或成孔单元）在胶凝后被滤出，以形成所需的孔。致孔剂包括盐，糖，活细菌，二氧化硅和明胶球。这种方法的困难在于去除致孔剂和互连水平不足。用于除去致孔剂的溶剂可能保留在支架内，具有细胞毒性，需要进行大量洗涤以防止或减少对细胞的有害作用。此外，保留在支架中的任何致孔剂都将影响互连，互连是血管向内生长和细胞浸润的重要考虑因素。因此，需优先使用无毒且易于去除的致孔剂。

低温法（图2b）避免了致孔剂，方法简单。溶剂晶体作为互连的致孔剂可避免诸如细胞毒性之类的问题，将冷冻凝胶简单地放在高于溶剂凝固点的温度可实现去除成孔剂。通常，将凝胶溶液冷却至-5至-20°C。此时很大一部分溶剂会结晶，但一部分凝胶溶液仍保持液态。当溶剂结晶时，水凝胶成分会浓缩在液体微相中，而不是保留在结晶的大相中。在适当的凝胶化时间后，将冷冻凝胶恢复到室温。随着溶剂晶体熔化，形成相互连接的大孔水凝胶。当完全水合时，由于在液/孔壁界面处的表面张力，尽管形成凝胶的溶剂晶体是锋利的，但凝胶的孔变得圆润。在溶剂结晶过程中，溶剂晶体会一直生长直至前沿与另一个晶体前沿接触，从而形成高度互连的多孔凝胶。

图2 （a）经典的大孔水凝胶形成与（b）冷冻凝胶的对比。

2.冷冻凝胶物理性质

冷冻凝胶的物理性质由许多变量决定，包括交联的程度和类型，凝胶溶液的组成，凝胶化温度，在该温度下保持的时间以及冷冻速率。

交联：低温凝胶的物理交联与化学交联的低温凝胶略有不同。尽管在给定温度（例如-20°C）下在溶液存储期间发生化学交联，但在解冻阶段却发生了聚合物（例如PVA）的物理交联。因此，物理冰晶中的交联度由除霜过程决定，从而更快的融化会导致相对较弱的凝胶。交联不仅影响凝胶的硬度，而且影响溶胀程度，进而影响凝胶的弹性和机械性能以及水合孔径。

温度：在较低温度下，溶剂结晶更快，导致大量较小的溶剂晶体成核。43由于溶剂结晶的增加，液相微相变得更加浓缩，从而导致孔壁变薄和致密。胶凝温度和孔径之间存在线性关系。

聚合物含量：凝胶的最终孔径也受聚合物的百分比和分子量的影响。与较大分子量聚合物的凝胶溶液相比，浓度相同的较低分子量聚合物的凝胶溶液导致较大的孔。这些观察结果与Mark–Kuhn–Houwink方程有关，较高分子量聚合物的溶液由于可结晶的溶液中游离水的含量相对较低而将产生较小的孔。较高聚合物浓度的溶液导致较小的平均孔径。可以通过增加可交联基团的使用量、增加交联和减少游离水的使用量的累积效应来解释这一现象。与常规水凝胶形成一样，聚合物含量的增加会增加冷冻凝胶的硬度。

低温浓缩：冷冻浓度可降低凝胶化所需的临界浓度，这使得具有低单体含量的凝胶溶液可以在室温下不会凝固。冷冻浓缩还可以加快胶凝速度，从而在物理和化学交联凝胶的最佳温度下，使冷冻凝胶更有效。图4中表明丙烯酰胺的凝胶聚合的凝胶化时间最短为-20°C，这是由于溶剂的快速结晶和液相微相中凝胶成分的浓缩所致。

图4 聚丙烯酰胺凝胶形成的时间与环境温度的关系。实线和点表示与在环境温度与在低温条件形成的凝胶。

冷却速度：为了制造均匀的大孔水凝胶，交联的速度必须慢于溶剂结晶的速度，否则聚合反应将在没有溶剂致孔剂的情况下发生，并产生非大孔凝胶。可通过减慢交联速度以形成晶体和生长来形成较大的孔。最佳的冷冻条件可由给定聚合物溶液的初始溶剂结晶温度和凝固点温度来得知。

3.物理表征

冷冻凝胶组织支架的物理特性（包括局部凝胶力学，孔径和互连性）会影响培养中的细胞。然而，由于冷冻凝胶的高度水合性质，难以确定结晶的溶剂的体积，进而确定孔壁的最终聚合物组成变得困难，其冷冻凝胶表征可能会成问题。

孔隙率：冷冻凝胶的孔隙率是通过从溶胀的凝胶中挤出多余的水，并将其重量（m压缩的凝胶）与溶胀的凝胶（m溶胀的凝胶）的重量进行比较来确定的。孔隙率≈m溶胀凝胶-m挤压凝胶/m溶胀凝胶。表征冰晶凝胶孔隙率的其他技术包括共聚焦显微镜，X射线微计算机断层扫描（μCT），压汞法，SEM和聚焦离子束（FIB）等。